La sua notorietà nel mondo dei fumetti deve molto alla realizzazione di due importanti saghe superoistiche negli anni ottanta (entrambe scritte da Frank Miller): Daredevil: Born Again (1986) e Batman: Anno uno (1987).
Ha studiato alla Rhode Island School of Design a New York, per cominciare subito dopo a lavorare nel mondo dei comics alla Marvel.
Il suo stile è eterogeneo e versatile, e riesce credibilmente ad illustrare storie di stampo supereroistico come digressioni autoriali o adattamenti letterari (celebre quello del racconto di Paul Auster, Città di vetro)
Dopo aver abbandonato il genere supereroistico dopo si è dedicato a progetti indipendenti, producendo in proprio alcuni numeri della rivista Rubber Blanket; ha poi partecipato a numerose antologie attraverso la realizzazione di storie brevi.
Come illustratore ha collaborato con il New Yorker, disegnando tavole destinate alle pagine interne e anche alcune copertine.
Nel 2009 viene pubblicato il graphic novel Asterios Polyp (in Italia pubblicato da Coconino Press), a cui ha lavorato per dieci anni.
Mazzuchelli vive a New York, dove si dedica anche all’insegnamento presso la School of Visual Arts.